一提起miRNA的發(fā)現(xiàn)，新一代測序就笑了。RNA-seq這種新技術(shù)發(fā)現(xiàn)，可鑒定SNP、突變和新的miRNA。RNA-seq通常被視為一種篩查技術(shù)。就目前而言，它以一種半定量但極透徹的方式鑒定樣本中的所有序列。當(dāng)然，它價格不菲，數(shù)據(jù)分析繁復(fù)，并非全部實驗室都有機會使用。
qRT-PCR這種經(jīng)典技術(shù)仍然是miRNA表達譜分析的方法，因為它符合您的所有期望：樣本量低、靈敏度高、特異性好以及動態(tài)范圍廣。在單次運行中，從10到107個拷貝的miRNA靶標(biāo)都能準(zhǔn)確定量。一般而言，每次分析需要1 ng總RNA，而miRNome的分析需要1 μg RNA。對于細胞系的分析，這點RNA當(dāng)然是小菜一碟，但并非所有研究都那么幸運。分選后的細胞、激光捕獲組織、循環(huán)腫瘤細胞如此珍貴，未必能實現(xiàn)。在此，我們就介紹一個基于PCR的系統(tǒng)，它能將miRNome分析所需的樣本量降低了幾個數(shù)量級，同時帶來了出色的重復(fù)性和性。
miRNA的預(yù)擴增
這就是來自QIAGEN的miScript® PreAmp Primer Mixes 。盡管市場上也有一些方法能預(yù)擴增miRNA，但miScript PCR System是*一種技術(shù)，包含了真正通用、小RNA特異的cDNA合成反應(yīng)。
在這種技術(shù)中，miRNA被大腸桿菌poly A聚合酶加尾，接著以oligo dT為引物合成cDNA。這確保了所有miRNA都能無偏向地轉(zhuǎn)化成cDNA。更重要的是，這包括了過去未曾鑒定的miRNA，讓您在發(fā)現(xiàn)了新的miRNA靶標(biāo)時能隨時返回到原先保存的cDNA樣本。在此，RNA的用量不是很關(guān)鍵，但QIAGEN建議cDNA合成反應(yīng)包含10 ng RNA（相當(dāng)于300個細胞）。每個cDNA合成反應(yīng)可用于10次預(yù)擴增反應(yīng)，每次1 μl（相當(dāng)于1 ng RNA或30個細胞）。更多RNA當(dāng)然也可以，但沒有必要。更少RNA也并非不行，但若少于3個細胞，取樣的差異會導(dǎo)致中等或低表達miRNA的結(jié)果發(fā)生變化。
預(yù)擴增過程是一個高度多重的PCR，以96或384個分析的形式開展，這對應(yīng)了QIAGEN預(yù)開發(fā)的96-和384-分析的miScript miRNA PCR Array。經(jīng)過12個循環(huán)的預(yù)擴增，其產(chǎn)物可與實時定量PCR預(yù)混液混合，用于miRNA表達譜分析。無論是10-20個拷貝的靶標(biāo)，還是107個拷貝的靶標(biāo)，如今都增長了4個數(shù)量級。這下，您再也不用擔(dān)心樣本量不夠了。FFPE組織，血液、尿液等體液都能采用這種辦法預(yù)擴增。
樣本量是夠了，但預(yù)擴增會不會影響miRNA表達譜本身呢？相信這是大家zui關(guān)心的問題。如此大量分析的同時開展，確實是個難題，但QIAGEN通過一些設(shè)計特征使其成為可能。首先，由于miScript PCR System采用通用的3’ PCR引物，預(yù)擴增引物庫的復(fù)雜度立即下降50%。其次，所有的擴增子都有著相同的大小和非常接近的Tm，這大大有利于多重反應(yīng)的無偏向擴增。zui后，cDNA合成反應(yīng)的試劑嚴(yán)重限制了cDNA副反應(yīng)，這樣背景cDNA極少，而預(yù)擴增反應(yīng)中的背景也極低。
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