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1. 為什么做靶向測序

高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，特別是二代測序的普及，使得科研人員能夠更容易更快速地獲取基因組信息。然而，一方面，獲取完整基因組仍然費(fèi)用較高，特別是進(jìn)行大量樣本檢測時(shí)。另一方面，如何發(fā)掘隱藏在海量測序數(shù)據(jù)背后的意義仍是短期內(nèi)無法解決的問題。所以現(xiàn)在就說，我們進(jìn)入了個(gè)人基因組時(shí)代還為時(shí)尚早。

在研究中，大多數(shù)的科研人員其實(shí)并不需要全部的基因組序列，也難以有效利用如此巨大的數(shù)據(jù)集。科研人員在很多情況下更需要高度的分析，例如檢測罕見疾病攜帶的變異，或是確保檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。此外，在的醫(yī)學(xué)中，當(dāng)人們只關(guān)注特定的基因或基因組區(qū)域時(shí)，受時(shí)間、費(fèi)用和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等因素限制，對特定基因集（幾十到幾百個(gè)熱點(diǎn)基因）或是基因組的特定區(qū)域進(jìn)行測序是更為合理的選擇。這種測序策略即為靶向測序。靶向測序能更經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)大量樣本的檢測，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)高于基因組測序的測序深度和靈敏度，并且大幅提升突變發(fā)現(xiàn)能力。

2. 靶標(biāo)捕獲可以更簡單嗎

目前主流的靶向序列捕獲方案主要有兩種，一種基于雜交靶向富集，另一種基于多重PCR靶向富集?，F(xiàn)有的靶向文庫制備方法都不同程度的存在著均一性差、序列脫靶、操作流程繁復(fù)、操作時(shí)間長以及高昂的前期設(shè)備投入等問題。有沒有新的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)更簡單的靶向文庫制備，又能獲取更高特異性和均一性的文庫？是不是能一次反應(yīng)就能同時(shí)完成靶向序列的捕獲和測序文庫的制備，而不需要額外的實(shí)驗(yàn)操作？

答案是肯定的。zui近上市的VariantPro™靶向文庫制備系統(tǒng)，是一個(gè)基于多重PCR又不同于傳統(tǒng)多重PCR的靶向文庫制備技術(shù)，這個(gè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了一步操作即完成從靶向序列捕獲到測序文庫制備的全過程，而整個(gè)過程中只需人工操作5分鐘。這個(gè)新系統(tǒng)采用了兩項(xiàng)技術(shù)：OmegaPrimer™和RelayPCR™。這兩項(xiàng)技術(shù)又有什么過人之處？

3. *的形似Ω的引物

OmegaPrimer™是一個(gè)*不同于傳統(tǒng)的，形似Ω的*引物。這個(gè)引物帶有3個(gè)功能區(qū)，5p臂設(shè)計(jì)保證了引物穩(wěn)定的結(jié)合模板，3p臂設(shè)計(jì)會(huì)雙重檢查結(jié)合特異性并啟動(dòng)聚合酶延伸，兩臂之間的loop環(huán)起到間隔作用，同時(shí)又為后續(xù)文庫擴(kuò)增提供通用引物（common primer）雜交的序列（圖1）。在OmegaPrimer™中3p臂被設(shè)計(jì)較短，因而在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，將大幅降低多重PCR體系中形成可擴(kuò)增引物二聚體幾率。這樣的設(shè)計(jì)大幅提升了引物的特異性，同時(shí)又能容忍模板出現(xiàn)個(gè)別堿基的突變。容忍模板出現(xiàn)個(gè)別堿基的突變有什么用處？這是一個(gè)非常有用的特性，考慮到在擁有30億個(gè)堿基對的人類基因組中有600萬個(gè)高等位基因頻率（> 1%）的SNPs，平均每500 bp就有1個(gè)SNP，這樣的引物寬容性就顯得非常必要了。

 
圖1 OmegaPrimer™含有3個(gè)功能區(qū)

4. 會(huì)自動(dòng)接力的PCR

RelayPCR™（接力PCR）將一對通用引物和成百上千對（甚至更多）特異性引物（OmegaPrimer™）與基因組DNA混合在一個(gè)樣品管中。運(yùn)行一次多重PCR即完成從特異性捕獲成百上千個(gè)靶向序列（區(qū)域）到高均一性制備測序文庫的全過程。這個(gè)設(shè)計(jì)帶來顯著簡化的工作流程。具體地，RelayPCR™可以通過控制成百上千對特異性引物（OmegaPrimer™）只在zui初靶標(biāo)捕獲的兩個(gè)循環(huán)中發(fā)揮作用，之后會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換到由一對通用引物（common primer）進(jìn)行的文庫擴(kuò)增反應(yīng)。這種實(shí)驗(yàn)策略消除了傳統(tǒng)多重PCR中多對特異性引物間存在的引物擴(kuò)增效率差異的現(xiàn)象，從而確保了制備高均一性文庫（圖2）。在設(shè)計(jì)通用引物時(shí)，可以引入二代測序所需的引物（包括barcode），并且兼容主流的illumina和Ion Torrent測序平臺(tái)。當(dāng)全部PCR反應(yīng)結(jié)束后，測序文庫也一起制備完畢。

 
圖2 RelayPCR™實(shí)驗(yàn)流程

由于反應(yīng)體系中common primer的量遠(yuǎn)大于specific primer（即omegaprimer™）的量，zui初靶標(biāo)捕獲的兩個(gè)循環(huán)結(jié)束后，體系中出現(xiàn)了可與common primer雜交的擴(kuò)增子時(shí)，PCR反應(yīng)即自動(dòng)切換到由一對common primer引導(dǎo)的文庫擴(kuò)增階段。與common primer雜交結(jié)合的序列，來自omegaprimer™的loop環(huán)。

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5. VariantPro™表現(xiàn)如何

? *的文庫均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技術(shù)，限制特異性引物（OmegaPrimer™）只在zui初2個(gè)循環(huán)——靶標(biāo)捕獲時(shí)發(fā)揮作用，接著會(huì)自動(dòng)切換到由通用引物主導(dǎo)的文庫擴(kuò)增循環(huán)，直到反應(yīng)結(jié)束，從而確保了生成*均一性的文庫（見圖3）。

擴(kuò)增子覆蓋的均一性通常是由＞0.2×擴(kuò)增子平均覆蓋度的序列所占百分比來測定。如下圖所示，VariantPro™系統(tǒng)制備的人類線粒體DNA文庫達(dá)到> 99.1%的均一性。

 
圖3 VariantPro™系統(tǒng)制備文庫具有*的文庫均一性

? *的重復(fù)性
樣品和文庫制備步驟中的誤差是破壞實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的一個(gè)潛在來源。這意味著實(shí)驗(yàn)越復(fù)雜就越可能增加實(shí)驗(yàn)誤差的幾率。VariantPro™具有極簡的工作流程，因而zui大限度地降低操作引起的誤差。測試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)行不同的PCR循環(huán)數(shù)或采用不同的起始DNA量，都不會(huì)顯著影響測序結(jié)果的重復(fù)性（見圖4，5）。

圖4 不同PCR循環(huán)次數(shù)（15至27個(gè)循環(huán)）的相關(guān)系數(shù)分析表明，PCR循環(huán)次數(shù)不會(huì)影響文庫組成。

圖5 不同的模板gDNA（1.0至10.0 ng）的相關(guān)系數(shù)分析表明，反應(yīng)所需模板量是靈活可變的。

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