ELISA 標(biāo)準(zhǔn)操作及技術(shù)服務(wù)的常見(jiàn)問(wèn)題
ELISA 標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn)
優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是 ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于 1.5μs/cm。
標(biāo)本的采取和保存
大部分 ELISA 檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。一般說(shuō)來(lái)，在 5 天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于 4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過(guò)一周測(cè)定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。 抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素
抗凝劑。
ut off 值附近血清的處理
1.cut off 值附近的值是客觀存在的
cutoff 值指經(jīng)過(guò)大量臨床調(diào)查后自行制定的判斷陰陽(yáng)性的界限。Cut off 值附近的值客觀存
在基于以下原因：大量臨床陰性樣本 A 值呈正態(tài)分布；這些陰性樣本 A 值是由低到高的連
續(xù)曲線；cutoff 值是這個(gè)連續(xù)曲線上的截?cái)嘀怠?/p>
1.1 正常血清 A 值的正態(tài)分布
95.46％
µ-2σ µ µ+2σ 圖一
當(dāng)試劑盒研發(fā)完成后，需要進(jìn)行大量的臨床樣品的考核。其中陰性血清的 A 值呈正態(tài)分布，大約 95％的陰性血清值與平均值相近，而有 5％的陰性血清則明顯低于或高于平均值，這是 cutoff 值可根據(jù) 95％的置信限來(lái)確定。若試劑盒的特異性很好，可用 98％作為置信限來(lái)確定 cutoff 值。但不論是選擇多少的置信限，總存在置信限以外的區(qū)域，該區(qū)域的部分樣品 A 值會(huì)高于 cutoff 值，從統(tǒng)計(jì)上說(shuō)是無(wú)法避免的。1.2 正常血清 A 值的連續(xù)分布經(jīng)過(guò)大量的臨床調(diào)查會(huì)發(fā)現(xiàn)，正常血清的 A 值是一條從小到大的連續(xù)曲線。在這條連續(xù)的曲線上，經(jīng)過(guò)計(jì)算選取一點(diǎn)作為 cutoff 值，這一點(diǎn)之下為陰性，之上為陽(yáng)性，因此 cutoff 值附近的值是必然存在的。
2.怎樣對(duì)待 cutoff 值附近的血清
2.1 本公司試劑盒有很好的敏感度和特異性，不提倡設(shè)置灰區(qū)，堅(jiān)持按照說(shuō)明書(shū)要求，大于等于 cutoff 的為陽(yáng)性。
2.2 某些檢驗(yàn)單位有劃灰區(qū)的習(xí)慣，灰區(qū)一般是在相應(yīng)的 cutoff 以下 8％－10％范圍內(nèi)，國(guó)家并沒(méi)有一定的規(guī)定，對(duì)于一定要設(shè)置灰區(qū)的單位，本公司建議在我們的 cutoff 值以下 10％為灰區(qū)。值得注意的是本公司的 HCVcutoff 是變化的，所以灰區(qū)也應(yīng)是變化的。
2.3 對(duì)于可疑樣本可采用多次數(shù)檢驗(yàn)的方法作為陰陽(yáng)性判斷的依據(jù)。如進(jìn)行 5 此重復(fù)性試驗(yàn)，有 3 次為陽(yáng)性，2 次為陰性，判斷樣本為陽(yáng)性
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