Annexin V-FITCPI凋亡檢測(cè)試劑盒操作注意以下幾點(diǎn)
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V 是一種分子量為35.8 KD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨-酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V 結(jié)合到凋亡細(xì)胞后，在藍(lán)色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染。將FITC-Annexin V 與PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨-酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用AnnexinV與PI雙染的方法，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。
注意事項(xiàng)：
1. 微量試劑需離?數(shù)秒將試劑收集?管底后再開(kāi)蓋取?。
2. Propidium Iodide（PI）、Annexin V-FITC有毒，操作時(shí)要帶?套，使?時(shí)避免與?膚，眼睛和黏膜接觸。
3. 本試劑盒?于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1x106。
4. 染?后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過(guò)?可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
5. Annixin V檢測(cè)凋亡細(xì)胞的?法適?于懸浮??的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于貼壁??的細(xì)胞，由于在胰-酶等消化處理過(guò)程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，會(huì)造成較?的假陽(yáng)性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，從而影響檢測(cè)，可將胰-酶消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防?進(jìn)?步的損傷。盡管?前，包括國(guó)外也有?些單位采?該?法檢測(cè)貼壁??的細(xì)胞。但不推薦，因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時(shí)?常??。
6. .細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。
7. .如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200g離心洗去血小板。
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